生物醫學交叉研究院王曉東團隊揭示程序性壞死細胞激活自身Ifnb表達的機制
清華新聞網7月7日電 程序性壞死是一種裂解性細胞死亡途徑，通過破壞細胞膜并釋放炎性細胞內容物引發炎癥。多種信號通路可激活程序性壞死。RIPK1、TRIF和ZBP1均含有受體相互作用蛋白同型作用基序（RHIM），可通過此結構域結合并激活下游蛋白RIPK3。激活的RIPK3進一步磷酸化MLKL，形成磷酸化MLKL（pMLKL）。pMLKL對帶負電的磷脂具有親和性，其寡聚體與細胞膜負電磷脂結合并打孔，導致細胞膜破損及細胞死亡。有研究發現，程序性壞死細胞中同時存在細胞膜修復機制：膜結合的pMLKL可通過Flotillin介導的內吞作用與ESCRT介導的外排作用被移除，從而抑制細胞膜破損。然而，細胞中累積的pMLKL是否還具有其他生物學功能，尚不清楚。
7月3日，清華大學生物醫學交叉研究院王曉東實驗室在《分子細胞》（Molecular Cell）雜志上以封面論文形式發表了題為“MLKL在誘導壞死下垂時通過釋放線粒體DNA激活cGAS-STING通路”（MLKL activates the cGAS-STING pathway by releasing mitochondrial DNA upon necroptosis induction）的研究。研究發現，在程序性壞死細胞中，I型干擾素表達上調，其中Ifnb上升最為顯著。敲除程序性壞死關鍵蛋白RIPK1、RIPK3或MLKL可完全抑制Ifnb表達，且此效應獨立于細胞膜破損。
細胞內Ifnb表達主要依賴于TBK1-IRF3信號軸的激活。在該程序性壞死體系中，可能有兩種途徑激活TBK1：第一，RIG-I/MDA5識別胞質雙鏈RNA后，通過下游MAVS蛋白激活TBK1；第二，cGAS識別胞質雙鏈DNA后，通過STING激活TBK1。研究人員發現，敲除MAVS不影響Ifnb表達，而敲除cGAS則顯著降低Ifnb表達。進一步敲低cGAS下游蛋白STING或TBK1雖不影響程序性壞死進程，但均能抑制Ifnb表達。這些結果表明，程序性壞死細胞中Ifnb表達上調是由cGAS-STING信號通路激活介導的。
cGAS是胞質游離雙鏈DNA感受器，可識別病毒、線粒體或核基因組來源的DNA。為探究程序性壞死中何種DNA激活了cGAS，研究人員分離了細胞的胞質組分（cytosol）。qPCR檢測顯示，胞質中游離的核基因組DNA含量基本不變，而線粒體DNA（mtDNA）含量顯著增加。免疫熒光結合超分辨成像顯示，誘導程序性壞死后，mtDNA從線粒體內部移出至線粒體外或限制于線粒體外膜。在線粒體DNA缺失的ρ0細胞中，程序性壞死仍能發生，但由于缺乏胞質游離mtDNA，Ifnb表達被抑制。
多種線粒體應激壓力可導致mtDNA釋放，例如線粒體內核酸酶EndoG缺失或mtDNA結合蛋白TFAM缺失等。然而程序性壞死細胞中這些蛋白并未減少。mtDNA釋放的可能途徑包括線粒體通透性轉換孔（mPTP）、VDAC寡聚化孔、Gasdermin家族蛋白或Bax/Bak等。但mPTP和VDAC寡聚化的抑制劑均不能抑制此mtDNA釋放。由于程序性壞死誘導體系中Z-VAD-fmk的存在，Gasdermin不會被切割活化。Bax/Bak雙敲除細胞也不能抑制程序性壞死中的mtDNA釋放。最終，研究人員確定寡聚的pMLKL是執行mtDNA釋放的關鍵。pMLKL寡聚化抑制劑13172可抑制mtDNA釋放。在線粒體膜開口處也觀察到了pMLKL的共定位。在純化的線粒體組分中檢測到pMLKL富集。線粒體膜富含帶負電的心磷脂，而MLKL對心磷脂具有高親和性。PLSCR3是負責將心磷脂從線粒體內膜轉運至外膜的翻轉酶，其缺失可抑制程序性壞死導致的mtDNA釋放。
圖1.寡聚pMLKL定位于線粒體外膜開口
為探究mtDNA釋放過程是否受調控，研究人員通過小規模化合物篩選發現微管完整性起關鍵作用。穩定微管結構的小分子不影響mtDNA釋放，而破壞微管結構的小分子則顯著抑制其釋放。免疫熒光結果顯示，微管結構破壞后，程序性壞死細胞內的線粒體雖發生分裂，但mtDNA仍被線粒體外膜包裹，不會釋放到胞質。然而微管結構的完整性并不影響pMLKL在線粒體上的富集。
部分極早發性炎癥性腸病（IBD）患者因Caspase8蛋白表達降低而導致腸上皮細胞發生程序性壞死。研究人員構建了腸上皮特異性誘導敲除Caspase8的小鼠模型。注射他莫昔芬誘導后，小鼠出現腸炎癥狀，包括腸上皮損傷、中性粒細胞浸潤和腸上皮杯狀細胞減少等。在腸上皮細胞中同時敲除RIPK3或MLKL，可完全抑制由程序性壞死引發的腸炎癥狀。透射電鏡在腸上皮細胞中觀察到破損的線粒體，分離的腸上皮細胞胞質中游離mtDNA也顯著增加。熒光原位雜交顯示IBD小鼠腸上皮中Ifnb表達顯著升高，干擾素刺激基因產物IFI44蛋白水平也增加。注射STING抑制劑H-151可降低腸上皮細胞中Ifnb表達和IFI44蛋白水平，減少中性粒細胞浸潤，并加速炎癥消退。
圖2.IBD腸上皮細胞線粒體破損伴隨Ifnb表達增加
圖3.程序性壞死細胞激活自身Ifnb表達的機制
綜上，研究團隊發現，在程序性壞死過程中，pMLKL除了破壞細胞膜外，還會導致線粒體膜破損并釋放mtDNA，進而激活cGAS-STING通路，誘導Ifnb表達。在程序性壞死誘發的小鼠IBD模型中，STING抑制劑能加速腸道炎癥消退。該研究深化了對程序性壞死的理解，并對IBD治療具有積極意義。
清華大學生物醫學交叉研究院王曉東實驗室的丁璋誠博士為論文第一作者，王曉東研究員為論文通訊作者。
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